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外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（Lymphocyte）、單核細胞（Monocyte）、樹突狀細胞（DC）和其他少量細胞。作為在免疫學、細胞治療等相關(guān)領(lǐng)域中的寶貴原料，卻在復蘇階段頻繁使人受挫——細胞死亡率高、狀態(tài)差、結(jié)團率高等問題屢見不鮮。因此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，針對PBMC復蘇的相關(guān) 問題，生成復蘇protocol，即IPHASE免疫細胞使用說明書。今天就讓我們來詳細了解一下PBMC復蘇的常見問題及正確復蘇流程。

01    外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）復蘇的常見問題

PBMC是人體免疫系統(tǒng)的核心成分，包含了T細胞、B細胞等關(guān)鍵免疫細胞。它如同一個“免疫信息寶庫"，是揭示疾病機制、評估免疫狀態(tài)和開發(fā)新療法的關(guān)鍵窗口。然而，PBMC的復蘇總是會伴有細胞結(jié)團、活性低、狀態(tài)差等問題，以下為PBMC復蘇的常見問題及其解決方案。

【問題描述】復蘇后，臺盼藍染色下，細胞活率低。

【解決方案】①避免細胞解凍時間多久，凍存管從液氮中取出后，應立即放入37℃水浴鍋，順時針不斷輕柔搖晃，控制在2min內(nèi)融化成冰晶狀態(tài)，轉(zhuǎn)入同樣經(jīng)37℃預熱的培養(yǎng)基中。② 確保凍存時細胞處于最-佳狀態(tài)，使用程序性降溫盒進行標準化凍存，并盡量使用新鮮的細胞及合適的凍存液。

【問題描述】細胞聚集成團，在鏡下聚集成大團塊，難以計數(shù)，影響后續(xù)實驗。

【解決方案】使用移液器輕柔地、多次吹散細胞團塊。避免用力過猛產(chǎn)生剪切力，損傷細胞。

【問題描述】計數(shù)結(jié)果不準，忽高忽低。

【解決方案】可能是細胞未充分混勻、團塊未吹散、臺盼藍染色時間過長或過短等原因造成的。①重懸細胞后，立即取樣計數(shù)；②確保計數(shù)前細胞是單顆粒懸液；③臺盼藍與細胞液按建議比例混合后，在1-2分鐘內(nèi)完成計數(shù)，因為染料本身對活細胞也有毒性。

【問題描述】凍存PBMC，復蘇后細胞亞群比例明顯改變。

【解決方案】凍存PBMC復蘇后細胞亞群比例是否改變與凍存液的凍存效果有關(guān)。凍存效果好的凍存液細胞凍存復蘇后活率高，則細胞亞群比例不會發(fā)生顯著改變。IPHASE推出的PBMC凍存液細胞復蘇后活率＞85%，滿足后續(xù)實驗要求。

【問題描述】凍存PBMC能否用于細胞分選試驗。

【解決方案】不同廠家要求不同，IPHASE生產(chǎn)的PBMC可搭配IPHASE細胞分選試劑盒進行后續(xù)分選試驗。

綜上所述，外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的復蘇小tips也極為重要，畢竟合適的復蘇流程，是確保細胞狀態(tài)、進行后續(xù)研發(fā)的關(guān)鍵！

02    外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的復蘇

以下為IPHASE針對上述復蘇難題，結(jié)合自己免疫細胞專用復蘇培養(yǎng)基，生成的一整套包含PBMC在內(nèi)的免疫細胞詳細復蘇流程。

【試驗試劑】

（1）0.4%臺盼藍溶液

（2）免疫細胞復蘇培養(yǎng)基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)

注：實驗開始前，請將 IPHASE Cell Thaw Medium 置于 37℃恒溫水浴鍋中預熱，備用。

【試驗流程】

（1）解凍：從液氮罐中取出細胞凍存管，擰松 1/4 管蓋釋放壓力，迅速擰緊并轉(zhuǎn)移到 37℃的水浴中，順時針輕柔搖動 90~120s，至凍存管中只有極小塊碎冰漂浮即可。

注：保持凍存管蓋始終處于水浴鍋液面以上，以防造成細胞污染。

（2） 轉(zhuǎn)移：從水浴鍋中取出凍存管，用 75%酒精對凍存管表面進行消毒，轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。 用寬口（可將普通槍頭剪去尖頭后滅菌）槍頭或巴氏吸管將細胞懸液吸出，緩慢滴加至裝有 9mL 預熱的 IPHASE Cell Thaw Medium 的無菌 15mL 離心管中，并使用預熱的 IPHASE Cell Thaw Medium 潤洗凍存管 2 次，1mL/次，輕微顛倒混勻。

（3） 計數(shù)：吸取適量細胞懸液進行細胞數(shù)量和活率的測定（細胞計數(shù)儀和手動計數(shù)均可）。

（4） 離心：設(shè)置離心力 350g，常溫離心 5-7min 后，棄上清，切勿接觸到細胞沉淀。

（5） 重懸：先使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或后續(xù)實驗培養(yǎng)基輕輕吹打懸浮細胞，再用 IPHASE Cell Thaw Medium 或后續(xù)實驗所需培養(yǎng)基補齊體積至 10mL。

（6） 二次離心：重復步驟 2.4。

（7） 再重懸：使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或其它適宜的培養(yǎng)基輕輕吹打懸浮細胞，再補充適量的培養(yǎng)基調(diào)整至適宜的濃度，即可進行后續(xù)試驗。

注：a.從液氮中取出細胞開始整個復蘇操作過程要迅速，避免影響細胞復蘇后的活性。

b.為保證復蘇效果，請使用 IPHASE Cell Thaw Medium。

c. 為避免對細胞產(chǎn)生機械損傷，整個操作過程盡可能輕柔。

經(jīng)IPHASE工作人員驗證，使用IPHASE生產(chǎn)的PBMC及相應免疫細胞，配合IPHASE免疫細胞復蘇培養(yǎng)基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)，按照如上操作流程，可得細胞復蘇活率在85%以上。

實例如下：

03    IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，除PBMC外，還有如T細胞、B細胞、NK細胞等多種免疫細胞，具體產(chǎn)品信息如下。